aatbio基于細(xì)胞的鈣通量測定法廣泛用于高通量篩選（HTS）中，以通過G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），大量完整的膜蛋白家族和藥物中的重要靶點類別確定激動劑刺激和拮抗劑抑制的信號傳導(dǎo)發(fā)現(xiàn)。準(zhǔn)確測量細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度和動員可以更全面地了解鈣調(diào)節(jié)的信號傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞功能和病理過程。

AAT Bioquest已開發(fā)的鈣指標(biāo)，包括大的集合的Fluo-8 ^®，卡爾-520 ^®，和Calbryte™鈣指標(biāo)，以及，鈣流測定法來跟蹤動員激烈的熒光信號和在各種波長選擇鈣從紫外線到紅外線。

aatbio鈣：通用信使

鈣是一種普遍存在的信使，會影響許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括鈣誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)確認(rèn)變化，細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞器鈣水平的調(diào)節(jié)，鈣介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的高度局限性及其在興奮性，胞吐作用，運動性中的特定作用。 ，凋亡和轉(zhuǎn)錄。這些途徑調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵的細(xì)胞過程，包括神經(jīng)傳遞，細(xì)胞增殖和肌肉收縮。在正常條件下，相對于細(xì)胞外液，鈣的靜息細(xì)胞質(zhì)濃度相對較低（約100 nM）。鈣信號傳導(dǎo)是通過從細(xì)胞內(nèi)儲存物中釋放鈣離子，或通過質(zhì)膜離子通道流入細(xì)胞外鈣而激活的。受刺激的細(xì)胞可將細(xì)胞質(zhì)鈣濃度增加至500至1000 nM。

定量胞漿鈣

顯示結(jié)合鈣后光譜響應(yīng)的熒光指示劑使研究人員能夠通過使用熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀，熒光光譜和熒光酶標(biāo)儀來研究細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的變化。為了便于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣動員并促進(jìn)被動擴散，將乙酰氧基甲基酯（AM酯）官能團(tuán)連接到鈣指示劑的核心結(jié)構(gòu)上。這增加了指示劑的疏水性，使其易于穿透完整的質(zhì)膜，并通過小化非特異性背景熒光來增強指示劑靈敏度，因為AM酯偶聯(lián)的指示劑基本上是無熒光且無活性的。

一旦探針進(jìn)入活細(xì)胞，并且僅在細(xì)胞內(nèi)酯酶除去AM酯官能團(tuán)后，才開始活性。激活后，探針會通過螯合檢測鈣，并通過生成相對于鈣濃度的熒光信號作出響應(yīng)。指標(biāo)如FLUO-8 ^®，AM（目錄號21080），加州-520 ^®，AM（目錄號21131）和Calbryte ^™  520，AM（目錄號20653）進(jìn)行了廣泛的鈣成像中使用，鈣通量分析以及用于藥物發(fā)現(xiàn)的基于細(xì)胞的高通量篩選（HTS）分析。鈣指示劑與流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡和熒光微孔板平臺兼容。除了提供熒光和發(fā)光鈣指示劑外，我們還提供了幾種非熒光鈣信號分子和螯合劑，用于測量和操縱細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外鈣。

單波長鈣指示劑

單波長鈣指示劑被廣泛用于監(jiān)測鈣動員，對鈣信號的空間動態(tài)進(jìn)行成像，以及在基于HTS細(xì)胞的藥理學(xué)篩選中，通過GPCR來分析激動劑刺激和拮抗劑抑制的信號。這些指示劑在飽和鈣水平下顯示出顯著的鈣依賴性熒光強度變化，而不會改變其吸收或發(fā)射波長。我們已經(jīng)開發(fā)了多種鈣指標(biāo)，包括FLUO-8 ^®，加州-520 ^®和Calbryte™系列，以動員跟蹤鈣與亮的熒光信號和各種波長和親和力的選擇，以滿足多種應(yīng)用。

單波長指示器的好處

• 靜息鈣水平下背景熒光小
• 改善的信噪比
• 大大提高了細(xì)胞保留
• 活細(xì)胞鈣分析的細(xì)胞滲透形式（與成像，流式細(xì)胞儀和微孔板檢測（例如HTS）兼容）
• 細(xì)胞不滲透形式，可通過微量注射，貼片移液器或松果體上樣進(jìn)行上樣
• 紫外線（UV），紫色和可見光激發(fā)格式
• 低，中和高親和力格式可提供滿足許多應(yīng)用的靈敏度范圍

圖1.在CHO-K1細(xì)胞中測得的ATP反應(yīng)。加入含丙磺舒的HH緩沖液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte™520 AM（Cat No. 20653）或含丙磺舒的HH Buffer中的10μg/ ml Fluo-4，AM（Cat No. 20550），并孵育45分鐘在37°C下。然后除去染料加載溶液，并用200 µL HH Buffer /孔替換。加入ATP（50 µL /孔）以達(dá)到指示的10 µM濃度，然后用顯微鏡FITC通道（Keyence）成像。

表1的Fluo-3的光譜進(jìn)行比較，的Fluo-4，的Fluo-8 ^®，加州-520 ^®和Calbryte™520個綠色熒光鈣指標(biāo)。

1. K _d：鈣解離常數(shù)。
2. Φ：在5 mM檸檬酸鈣存在下的熒光量子產(chǎn)率。
3. F _Ca / F _Free：相對于無鈣指示劑形式，鈣結(jié)合指示劑的熒光強度增加。

表2. Rhod-2，Rhod-4™，Rhod-5N和Rhod-FF橙/紅熒光鈣指示劑的光譜比較。

1. K _d：鈣解離常數(shù)。

比例鈣指標(biāo)

與單波長指示器相比，比率式（或雙波長）指示器具有*的光譜特性，這些光譜特性是響應(yīng)鈣離子結(jié)合而觸發(fā)的。當(dāng)與鈣結(jié)合時，比例指示劑的佳吸收率或發(fā)射波長強度都會發(fā)生變化。例如，雙重激發(fā)鈣指示劑Fura-2，AM和Fura-8™，AM在結(jié)合或不含鈣時均顯示兩個峰值激發(fā)波長。當(dāng)分別在結(jié)合鈣的和無鈣的峰值激發(fā)波長下激發(fā)時，鈣濃度的增加會引發(fā)雙激發(fā)指示劑的熒光發(fā)射強度的增加和減少。

比例指標(biāo)的好處

• 比例測定可準(zhǔn)確測量細(xì)胞內(nèi)鈣濃度
• 小化不均勻染料加載，染料滲漏，光漂白和變化的細(xì)胞厚度（在混合種群中常見）的影響
• 提供更可靠和可重復(fù)的結(jié)果
• 雙重激勵或雙重排放格式的指示器
• 活細(xì)胞鈣分析的細(xì)胞滲透形式（與成像，流式細(xì)胞儀和微孔板檢測（例如HTS）兼容）
• 細(xì)胞不滲透形式，可通過微量注射，貼片移液器或松果體上樣進(jìn)行上樣
  • 選擇不滲透細(xì)胞的比例指示器。

圖2.在用的Fura-2 AM（目錄號測量CHO-K1細(xì)胞的ATP劑量響應(yīng)21023）和的Fura-8™AM（目錄號21056）。將CHO-K1細(xì)胞以40,000個細(xì)胞/ 100 µL /孔在黑壁/透明底部96孔板中過夜接種，然后與Fura-2 AM或Fura-8 AM鈣測定染料上樣溶液孵育1小時。ATP劑量由Flexstation添加。

比例鈣指示劑指南

下表列出了細(xì)胞滲透性鈣比率指示劑的規(guī)格，其吸收和發(fā)射大值以及鈣解離常數(shù)。還可以使用每種比例指示劑的不滲透細(xì)胞的鉀鹽和鈉鹽衍生物。

Calbryte™鈣指示劑

該Calbryte™系列是為監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣動員亮和強大的鈣指標(biāo)的家庭。它包括三種新穎的鈣指示劑，Calbryte™520，Calbryte™590和Calbryte™630，它們的吸收和發(fā)射波長主要不同。Calbryte™探針以顯著更高的信號本底特性發(fā)射熒光信號，并大大增強了細(xì)胞保留能力。Calbryte™系列已經(jīng)過優(yōu)化，可用于熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀。它們還可以用于高通量篩選應(yīng)用。

Calbryte™系列的優(yōu)點

• 在相同條件下，Calbryte™探針比任何其他鈣指示劑都明顯更亮
• 大大提高了信噪比
• 增強的細(xì)胞內(nèi)保留，消除了丙磺舒的使用
• 45至60分鐘內(nèi)即可快速方便地裝載細(xì)胞
• 均質(zhì)胞質(zhì)定位
• 紅移的Calbryte™590和Calbryte™630可與GFP或其他綠色熒光染料一起使用以進(jìn)行多路復(fù)用

圖3.在使用CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體ATP的熒光信號響應(yīng)的比較屏幕任務(wù)™Calbryte™520鈣測定試劑盒，F(xiàn)LIPR ^®鈣4分析（Molecular Devices）中，和的Fluo-4的直接™鈣離子測定（分子探針^®）。將CHO-K1細(xì)胞以50,000個細(xì)胞/ 100 µL /孔在96孔黑壁/透明底部肋骨板上接種過夜。鈣通量響應(yīng)分別用所有三種測定法測量。FlexStation 3添加了ATP（50 µL /孔）以達(dá)到指示的濃度。

Calbryte™系列鈣指示劑指南

下表列出了Calbryte™鈣指示劑的規(guī)格，其吸光度和發(fā)射大值以及鈣解離常數(shù)。還可以使用Calbryte™鈣指示劑的其他包裝規(guī)格

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

CAL-520 ^®鈣指標(biāo)

在CAL-520 ^®系列是熒光鈣敏感染料的全面的產(chǎn)品組合。它包括六個指標(biāo)，加州-500™，加州-520 ^®，加州-590™，加州-630™，加州-670™和CAL-770™，它主要是在它們的吸收和發(fā)射波長不同。每種校準(zhǔn)染料在鈣的靜置水平下發(fā)出的熒光極少，在飽和鈣濃度下其熒光強度增加> 100倍。Cal染料可以以細(xì)胞可滲透的AM酯形式以及不滲透細(xì)胞的鉀鹽，鈉鹽和葡聚糖結(jié)合物形式提供。

在CAL-520的優(yōu)點^®系列

• 比Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2和Rhod-5更高的信噪比
• 增強的細(xì)胞內(nèi)保留
• 方便高效的細(xì)胞加載
• 均質(zhì)胞質(zhì)定位
• 紅移的Cal-590™，Cal-630™，Cal-670™和Cal-770™可與GFP或其他綠色熒光染料一起使用，以進(jìn)行多路復(fù)用
• Cal-770™可用于體內(nèi)研究
• CAL-520 ^®，CAL-590™，CAL-630™，在可供™CAL-670™和CAL-770 3000兆瓦和10000種兆瓦葡聚糖綴合物格式

圖4.用Cal-520™AM（目錄號）或Fluo-4 AM（目錄號）孵育的CHO-K1細(xì)胞中ATP刺激的內(nèi)源P2Y受體鈣反應(yīng)。將CHO-K1細(xì)胞以每100 µL每孔50,000個細(xì)胞的接種量在Costar黑墻/透明底部96孔板中過夜。將HHBS中的100 µL 5 µM Fluo-4 AM或Cal 520™AM（不含丙磺舒）加到樣品中，并在37°C下孵育1小時。使用FlexSation添加ATP（50 µL /孔）以達(dá)到指示的濃度。

CAL-520 ^®系列鈣指示劑導(dǎo)向

下表列出了規(guī)格為校準(zhǔn)-520 ^®鈣指示劑系列，它們的吸收率和發(fā)射大值，和它們的鈣離解常數(shù)。在CAL-520的其他包裝規(guī)格^®鈣指示劑系列可供選擇，

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

FLUO 8 ^®鈣指標(biāo)

FLUO-8 ^® AM地址的主要限制常見的基于FLUO染料，即要求小區(qū)負(fù)載的苛刻條件之一。需要加載傳統(tǒng)的基于Fluo的染料，例如Fluo- 2 AM（Cat No. 20495），F(xiàn)luo-3 AM（Cat No. 21013）和Fluo-4 AM（Cat No. 20550），并在37°C與細(xì)胞孵育長達(dá)一個讀數(shù)可以采取前一小時，這不僅科目細(xì)胞苛刻的溫度下，也需要用戶花費時間的加熱和冷卻細(xì)胞培養(yǎng)物。此外，它引入了溫育溫度為可能的混雜變量。FLUO-8 ^® AM通過提供可以在室溫下被加載到細(xì)胞中的魯棒鈣指示劑解決所有這些問題。FLUO-8 ^®AM與其他基于氟的染料相比，對溫度的依賴性較小，因此可以在更寬的實驗條件下獲得更一致的結(jié)果。此外，具有少至20分鐘的溫育時間，的Fluo-8 ^® AM能夠改善生產(chǎn)率快速周轉(zhuǎn)。好的部分是，即使結(jié)構(gòu)上的修改和改進(jìn)，F(xiàn)LUO-8 ^® AM的光譜特性保持不變，保持的Fluo-4 AM的熟悉光譜（即實施例/ EM = 494 / 517nm）。

在8的Fluo的好處^®系列

• 更快的細(xì)胞加載：8的Fluo ^®可以很容易地裝載到在室溫下的細(xì)胞。Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37°C的加載溫度
• 亮的熒光：8的Fluo ^®是2倍亮度比的Fluo-4 AM，和比的Fluo-3AM明亮4倍
• 方便：8的Fluo ^®的相同光譜的那些的Fluo-4和的Fluo-3使升級容易的

學(xué)到更多：

• Fluo-3和Fluo-4鈣指標(biāo)

圖5.在HEK-293細(xì)胞中測出的卡巴膽堿劑量反應(yīng)。將Hek-293細(xì)胞以40,000個細(xì)胞/ 100 µL /孔在Costar黑墻/透明底部96孔板中過夜接種。將細(xì)胞使用的Fluo-8用100μL的染料加載溶液中溫育^® AM（目錄號21083）或熒光4 AM（目錄號20550）在室溫下1小時。用NOVOstar（BMG Labtech）加入Carbachol（50μL/孔）達(dá)到指示的濃度。

FLUO 8 ^®鈣指示劑導(dǎo)向

下面列出規(guī)格表中為8的Fluo ^®鈣指示劑系列，它們的吸收率和發(fā)射大值，和它們的鈣離解常數(shù)。在8的Fluo附加的包裝規(guī)格^®鈣指示劑系列avaible，

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

Fluo-3

Fluo-3是鈣指示劑，于1989年*推出，用于流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡。熒光素樣化合物Fluo-3在沒有游離Ca ²⁺的情況下實際上是無熒光的。但是，與鈣結(jié)合后，F(xiàn)luo-3在525 nm處的發(fā)射強度會急劇增加。作為指示劑，F(xiàn)luo-3在細(xì)胞信號通路，肌細(xì)胞和神經(jīng)遞質(zhì)激活研究中至關(guān)重要。

Fluo-4

Fluo-4建立在Fluo-3的核心結(jié)構(gòu)上，但對其進(jìn)行了修改以提高熒光信號強度。化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致Fluo-4的大激發(fā)藍(lán)移，從506nm（Fluo-3）到494nm。實際上，這12 nm的偏移將Fluo-4的大激發(fā)光移至接近標(biāo)準(zhǔn)氬激光的波長（即488 nm）。這會導(dǎo)致更好的激發(fā)，從而產(chǎn)生熒光信號，該信號明顯更亮并且對鈣濃度的變化更敏感。

圖6.將 U2OS細(xì)胞以40,000個細(xì)胞/ 100 µL /孔在96孔黑色壁/透明底部肋骨板上接種過夜。生長培養(yǎng)基除去，將細(xì)胞用100μL的Fluo-3 AM的，的Fluo-4 AM和的Fluo-8孵育^®在4μM的在37℃，5％CO的濃度AM在HHBS ₂培養(yǎng)箱中1小時。細(xì)胞用200 µL HHBS洗滌兩次，然后使用FITC通道在熒光顯微鏡（Olympus IX71）上成像。

Fluo 3和Fluo 4鈣指示劑指南

下表列出了Fluo 3，F(xiàn)luo 4和Fluo 5鈣指示劑的規(guī)格，其吸收和發(fā)射大值以及其鈣解離常數(shù)。

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

產(chǎn)品訂購信息

非熒光鈣螯合劑，信號分子和測定試劑

傳統(tǒng)單波長鈣指標(biāo)

比例鈣指標(biāo)

Calbryte™鈣指示劑

CAL-520 ^®鈣指示劑系列

Fluo- ^8®，F(xiàn)luo-5，F(xiàn)luo-4和Fluo-3鈣指示劑系列